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單細(xì)胞免疫組庫測序一次實(shí)驗(yàn)可以同時(shí)檢測近萬個(gè)細(xì)胞，可在一個(gè)樣本中同時(shí)獲5'端mRNA表達(dá)譜、TCR和BCR的信息，結(jié)合基因的表達(dá)譜和V（D）J數(shù)據(jù)進(jìn)行復(fù)雜組織樣本的影響免疫應(yīng)答分析，監(jiān)測免疫療法的效果，研究疾病發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制。

1. 成熟的實(shí)驗(yàn)體系：單次實(shí)驗(yàn)可完成1,000–10,000個(gè)細(xì)胞的文庫構(gòu)建，同步獲得轉(zhuǎn)錄組與免疫組（TCR/BCR）數(shù)據(jù)，累計(jì)項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)2000+。
2. 標(biāo)準(zhǔn)化全流程質(zhì)控：具備完善的免疫組庫測序流程，支持V(D)J全長序列的配對信息獲取，確保數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。
3. 個(gè)性化數(shù)據(jù)分析與可視化：提供專業(yè)的免疫組庫數(shù)據(jù)分析服務(wù)，結(jié)合單細(xì)胞分析云平臺，可一鍵生成交互式動(dòng)態(tài)報(bào)告。
4. 成果支持與學(xué)術(shù)影響力：相關(guān)測序經(jīng)驗(yàn)已助力多項(xiàng)高水平SCI論文發(fā)表，具備較強(qiáng)的科研支撐能力。

樣本類型：
組織、血液、培養(yǎng)的細(xì)胞系、制備好的單細(xì)胞懸液
注：若客戶樣本為組織，烈冰將盡可能提供技術(shù)及實(shí)驗(yàn)上的幫助。

取樣大?。?br> 1.新鮮組織：50-100mg，體積約黃豆粒大?。ㄒ暯M織情況而定）；
2.穿刺樣本：采集3-5根1cm以上穿刺樣本條。

質(zhì)控要求：
1. 消化后細(xì)胞數(shù)量要盡量保證在1×106以上，特殊情況下，也要保證有1×105以上細(xì)胞
2. 細(xì)胞活性大于80%；背景碎片相對較少。

注意事項(xiàng)：
1.如樣本為細(xì)胞懸液，初始細(xì)胞量要盡量保證在1×106以上；特殊情況下，也要保證有1×105以上細(xì)胞；運(yùn)輸所需試劑為此類細(xì)胞最適用的培養(yǎng)液，并保證含有2%-5%的血清；
2.實(shí)體組織需要新鮮的樣本，且不可以經(jīng)過速凍、甲醛固定等處理；
3.取樣時(shí)如有血凝塊，可以在取樣后使用PBS清洗粘在組織塊上的血液，同時(shí)去除附著組織；
4.運(yùn)輸前，要將組織放置在組織保存液或緩沖液中（注意應(yīng)無鈣、鎂、EDTA等影響酶活性物質(zhì))；
5.若是外周血（全血)樣本，取樣時(shí)需置于EDTA抗凝管中，保證EDTA抗凝管沒有過期，采血管無破損且血液離體后不超過48h，外周血體積需要4ml以上，樣本無嚴(yán)重溶血、無血凝塊；
6.在4℃條件下運(yùn)輸，一般用碎冰盒中維持低溫，切忌用干冰、液氮等進(jìn)行運(yùn)輸。

抗 BCMA CAR-T 為 PMS 治療帶來新希望
該研究是全球首個(gè)抗 BCMA CAR-T 治療 PMS 的人體試驗(yàn)（NCT04561557），5 例患者（1 例原發(fā)性 PMS、4 例繼發(fā)性 PMS）接受治療后，展現(xiàn)出三大關(guān)鍵療效與安全性特征：
1.安全性優(yōu)異：僅出現(xiàn) 1 級細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS），無≥2 級 CRS；≥3 級血細(xì)胞減少均在 40 天內(nèi)恢復(fù)，無嚴(yán)重貧血或血小板減少。
2.中樞靶向性強(qiáng)：CAR-T 細(xì)胞可穿透血腦屏障，在腦脊液中持續(xù)擴(kuò)增且耗竭特征降低，同時(shí)實(shí)現(xiàn)中樞（腦脊液、骨髓）與外周的漿細(xì)胞深度清除。
3.神經(jīng)功能顯著改善：所有患者 EDSS 評分（殘疾評估量表）下降，9 孔插板試驗(yàn)（上肢功能）、25 英尺步行試驗(yàn)（下肢功能）耗時(shí)縮短，腦脊液神經(jīng)絲輕鏈（NfL，神經(jīng)損傷標(biāo)志物）水平降低，且無新增腦病灶。

多維度捕捉治療動(dòng)態(tài)，破解 “中樞靶向” 難題
要解析 CAR-T 細(xì)胞如何在中樞發(fā)揮作用，需精準(zhǔn)追蹤其在 “血液 - 腦脊液 - 骨髓” 三大 compartments 的動(dòng)態(tài)變化，以及對免疫微環(huán)境的調(diào)控。該研究的單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)圍繞 “時(shí)間 - 空間 - 多組學(xué)” 三維度展開，烈冰生物全程參與方案優(yōu)化與數(shù)據(jù)解析：
1. 樣本設(shè)計(jì)：
覆蓋 “關(guān)鍵部位 + 全治療周期”
為完整捕捉 CAR-T 細(xì)胞的體內(nèi)軌跡，研究采集了患者治療前基線、CAR-T 輸注后 10 天（擴(kuò)增峰值）、1 個(gè)月、3 個(gè)月、6 個(gè)月的三類核心樣本：

·外周血（反映全身 CAR-T 細(xì)胞動(dòng)力學(xué)）
·腦脊液（直接評估中樞內(nèi)治療效應(yīng)）
·骨髓（漿細(xì)胞富集部位，評估靶向清除效果

同時(shí)納入 CAR-T 輸注產(chǎn)品樣本，形成 “輸入 - 體內(nèi)分布 - 療效關(guān)聯(lián)” 的完整數(shù)據(jù)鏈。

2. 技術(shù)平臺：
多組學(xué)整合，實(shí)現(xiàn) “轉(zhuǎn)錄 + 蛋白+ 表觀”?全景分析 采用 10x Chromium 平臺開展單細(xì)胞多組學(xué)測序，通過 “多技術(shù)聯(lián)用” 解析細(xì)胞功能與調(diào)控機(jī)制，烈冰生物負(fù)責(zé)所有數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化分析：

多組學(xué)整合：通過 Seurat、Harmony 實(shí)現(xiàn) scRNA-seq 與 CITE-seq 數(shù)據(jù)對齊，用 ArchR 關(guān)聯(lián) scATAC-seq 與轉(zhuǎn)錄組信息，確?？缂夹g(shù)數(shù)據(jù)一致性。

從數(shù)據(jù)到機(jī)制，解密 CAR-T 治療的 “黑箱”
抗 BCMA CAR-T 為何能在中樞起效？其在不同組織中的存活、擴(kuò)增規(guī)律如何？烈冰生物通過針對性分析，逐一破解這些關(guān)鍵問題，為研究提供了 6 大核心分析成果：
1. 單細(xì)胞分群與 CAR-T 細(xì)胞精準(zhǔn)識別
通過整合轉(zhuǎn)錄組與蛋白數(shù)據(jù)（CITE-seq 的 CAR 蛋白信號），從 498,114 個(gè)細(xì)胞中精準(zhǔn)篩選出 CAR-T 細(xì)胞，并進(jìn)一步注釋為17個(gè) T 細(xì)胞亞群（如 CD8 + 效應(yīng) T 細(xì)胞、CD4 + 效應(yīng)記憶 T 細(xì)胞）。發(fā)現(xiàn)腦脊液中的 CAR-T 細(xì)胞耗竭特征更低（氧化應(yīng)激與線粒體功能紊亂減輕），且在1個(gè)月時(shí)出現(xiàn)遲發(fā)性克隆擴(kuò)張，為其長期中樞駐留、持續(xù)發(fā)揮作用提供了證據(jù)。

研究以 scRNA-seq、scTCR/BCR-seq、CITE-seq 與 scATAC-seq 對血液、腦脊液（CSF）、骨髓及輸注產(chǎn)物進(jìn)行聯(lián)合解析：質(zhì)控后共獲 498,114 個(gè)高質(zhì)量細(xì)胞，按經(jīng)典標(biāo)記劃分為 17 個(gè)細(xì)胞群；其后從中提取 217,820 個(gè) T 細(xì)胞再聚類得到 17 個(gè) T 細(xì)胞亞群，并有 199,712（91.7%） 個(gè)可檢測到 TCR 序列。通過 CAR 轉(zhuǎn)基因比對 + CITE-seq 的 CAR 蛋白信號，在三處解剖部位均可精準(zhǔn)識別 CAR-T 細(xì)胞；擴(kuò)增期以 CD8? 效應(yīng)/效應(yīng)記憶（CD8T_GZMB/CD8T_GZMK） 主導(dǎo)，而 CSF 中則呈 CD4? Tem（CD4T_GZMK/IL7R） 的相對持續(xù)?；蚰K打分與多組學(xué)結(jié)果一致表明，CSF 內(nèi) CAR-T 細(xì)胞“細(xì)胞毒性相當(dāng)?shù)慕吒汀?，其低耗竭與氧化應(yīng)激與線粒體功能紊亂減輕相聯(lián)系；時(shí)序上在外周（血液/骨髓）約第 10 天達(dá)擴(kuò)增峰值后，CSF 于約 1 個(gè)月出現(xiàn)遲發(fā)性克隆擴(kuò)張并長期可檢出，為 CAR-T 的中樞駐留與持續(xù)發(fā)揮作用提供了直接證據(jù)。

2、T 細(xì)胞克隆動(dòng)力學(xué)追蹤：揭示 “跨部位遷移” 規(guī)律
利用 scTCR-seq 數(shù)據(jù)，追蹤 CAR-T 細(xì)胞在血液、腦脊液、骨髓中的克隆擴(kuò)張動(dòng)態(tài)：

·外周血與骨髓中，CAR-T 細(xì)胞在 10 天達(dá)到克隆擴(kuò)張峰值；

·腦脊液中，CAR-T 細(xì)胞克隆多樣性更高，1 個(gè)月時(shí)才出現(xiàn)顯著擴(kuò)增；
·克隆重疊分析顯示，擴(kuò)增期（10 天）的 CAR-T 細(xì)胞可在三部位間遷移，證實(shí)其具備穿透血腦屏障的能力 —— 這一發(fā)現(xiàn)為 “CAR-T 中樞靶向性” 提供了直接數(shù)據(jù)支持。

研究揭示了 CAR-T 克隆在不同解剖位點(diǎn)的先外周后中樞的擴(kuò)增軌跡與跨部位遷移：在外周血與骨髓中，CAR-T 細(xì)胞于輸注后約第 10 天出現(xiàn)顯著克隆擴(kuò)張，常見具有 ≥10 條相同 TCR 序列的高頻克??；而在腦脊液內(nèi)，第 10 天仍以更高的克隆多樣性和相對有限的擴(kuò)增為主，至約 1 個(gè)月才出現(xiàn)顯著放大，并伴隨處于 S/G2/M 細(xì)胞周期的克隆比例上升以及高頻克隆占比增加?？寺≈丿B分析顯示，擴(kuò)增高峰期（第 10 天）血液、腦脊液與骨髓三處存在顯著共享克隆，且 1 個(gè)月時(shí)腦脊液中仍能檢測到與外周共享的擴(kuò)增克隆，提示在最大擴(kuò)增階段存在增強(qiáng)的跨部位遷移，支持 CAR-T 穿越血腦屏障并在中樞定植的能力；同時(shí)，擴(kuò)增期以 CD8? 效應(yīng)/效應(yīng)記憶克隆放大為主，進(jìn)入消退期后腦脊液中 CD4? 效應(yīng)記憶克隆相對持續(xù)，構(gòu)成外周快速爆發(fā)—中樞遲發(fā)擴(kuò)增—腦脊液持續(xù)的時(shí)序閉環(huán)。

3. B 細(xì)胞譜系分析：證實(shí) “漿細(xì)胞深度清除” 機(jī)制
PMS 的核心病理是中樞漿細(xì)胞分泌自身抗體引發(fā)炎癥，烈冰生物通過 BCR 測序與轉(zhuǎn)錄組整合，解析 B 細(xì)胞譜系變化：

·基線時(shí)，腦脊液漿細(xì)胞的 CDR3 區(qū)替換突變 / 沉默突變（R/S）比值 > 1.5（健康人約 1），提示其受強(qiáng)抗原選擇，參與病理過程；

·治療后 3 個(gè)月，三部位漿細(xì)胞顯著減少，且殘留漿細(xì)胞的 BCR 突變頻率與 R/S 比值降至正常水平，同時(shí)腦脊液寡克隆帶（OCB）減少、游離輕鏈（KFLC）降低 —— 直接證實(shí)抗 BCMA CAR-T 可清除致病性漿細(xì)胞。

基于 BCR 測序與轉(zhuǎn)錄組整合，研究顯示治療前患者腦脊液中的漿母細(xì)胞/漿細(xì)胞處于強(qiáng)烈抗原選擇壓力，其 CDR3 區(qū)替換/沉默突變比值（R/S）平均大于 1.5，明顯高于健康對照約 1 的水平，提示這類細(xì)胞深度參與進(jìn)展型多發(fā)性硬化的中樞免疫病理，且在 PPMS 個(gè)體中更為突出。治療后 3 個(gè)月內(nèi)，三部位（血液、骨髓、腦脊液）的漿母細(xì)胞/漿細(xì)胞顯著減少，殘留細(xì)胞的突變頻率與 R/S 比值回落至接近正常范圍，顯示 B 細(xì)胞譜系逐步回歸生理區(qū)間；同時(shí)腦脊液寡克隆帶減少，游離輕鏈及其指數(shù)下降，免疫球蛋白水平降低，共同證明靶向 BCMA 的 CAR-T 能深度清除致病性漿細(xì)胞并逆轉(zhuǎn)中樞免疫失衡。

4. 細(xì)胞互作分析：破解 “小膠質(zhì)細(xì)胞活化” 調(diào)控
小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化是神經(jīng)損傷的關(guān)鍵，研究通過 CellChat 分析發(fā)現(xiàn)：

·基線時(shí)，腦脊液中 B 細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞存在強(qiáng)互作，B 細(xì)胞通過 TNF-α/NF-κB 通路驅(qū)動(dòng)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥；

·治療后，隨著 B 細(xì)胞清除，小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥通路（如細(xì)胞因子產(chǎn)生、抗原呈遞）顯著下調(diào)，細(xì)胞間互作強(qiáng)度降低 —— 這一機(jī)制解釋了為何患者神經(jīng)損傷標(biāo)志物（NfL）下降。

基于 CellChat 的配體–受體網(wǎng)絡(luò)推斷顯示，治療前腦脊液內(nèi)的 B 細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞存在顯著增強(qiáng)的通訊軸，B 細(xì)胞經(jīng)由 TNF-α/NF-κB 等促炎通路驅(qū)動(dòng)小膠質(zhì)細(xì)胞處于高度活化與抗原呈遞增強(qiáng)的狀態(tài)，伴隨細(xì)胞因子與趨化因子信號的放大。隨抗 BCMA CAR-T 清除致病性漿細(xì)胞與相關(guān) B 細(xì)胞后，小膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的炎癥與抗原呈遞通路下調(diào)，配體–受體互作強(qiáng)度總體減弱，并呈現(xiàn)向更為穩(wěn)態(tài)、低炎癥表型回落的趨勢；這一網(wǎng)絡(luò)層面的重塑與體液學(xué)神經(jīng)損傷標(biāo)志物 NfL 的下降相一致，為“清除 B 細(xì)胞—緩解小膠質(zhì)過度活化—減輕神經(jīng)軸突損傷”的機(jī)制鏈條提供了直接支持。

5. 表觀調(diào)控解析：找到 CAR-T 細(xì)胞 “耗竭關(guān)鍵因子”
結(jié)合 scATAC-seq 數(shù)據(jù)，分析不同部位 CAR-T 細(xì)胞的染色質(zhì)可及性：

·骨髓中的 CAR-T 細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（SMAD4、ID3）motif 富集，導(dǎo)致其耗竭更快、存活時(shí)間短；
·腦脊液中的 CAR-T 細(xì)胞無此表觀特征，耗竭標(biāo)志物（如 PD-1）表達(dá)更低 —— 為優(yōu)化 CAR-T 細(xì)胞持久性提供了表觀靶點(diǎn)。

基于 scATAC-seq 與轉(zhuǎn)錄組聯(lián)用的部位對比，研究發(fā)現(xiàn)在骨髓內(nèi)的 CAR-T 細(xì)胞呈現(xiàn)以氧化應(yīng)激為核心的表觀學(xué)指紋：染色質(zhì)可及性在 SMAD4、ID3 等與耗竭/代謝應(yīng)激相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子位點(diǎn)顯著富集，并伴隨氧化應(yīng)激與線粒體功能紊亂信號上揚(yáng)，對應(yīng)更快進(jìn)入功能衰竭與較短持續(xù)期。相比之下，腦脊液中的 CAR-T 細(xì)胞缺乏上述表觀學(xué)富集，氧化應(yīng)激與線粒體紊亂評分降低，耗竭表型減輕，典型耗竭標(biāo)志（如 PD-1）表達(dá)更低，提示通過干預(yù) SMAD4、ID3 等通路有望提升 CAR-T 在中樞環(huán)境中的持久性與功能續(xù)航。

6. 臨床數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)：搭建 “分子機(jī)制 - 療效” 橋梁
將單細(xì)胞分析結(jié)果與臨床指標(biāo)（EDSS 評分、NfL、影像學(xué)）關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)：

·腦脊液 CAR-T 細(xì)胞克隆多樣性越高、漿細(xì)胞清除越徹底的患者，EDSS 評分下降越顯著；
·小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥通路下調(diào)程度與 MRI 病灶體積縮小正相關(guān) —— 為臨床療效預(yù)測提供了分子標(biāo)志物。

將單細(xì)胞多組學(xué)與臨床讀出對齊后，研究呈現(xiàn)出一致的機(jī)制—效應(yīng)閉環(huán)：CSF 內(nèi) CAR-T 的低耗竭表型與更持久的擴(kuò)增、較高的克隆多樣性（含遲發(fā)性放大）與功能量表改善相伴；體液學(xué)方面，KFLC 及其指數(shù)下降、OCB 部分轉(zhuǎn)陰與 PB/PCs 的顯著清除同向變化，提示致病性漿細(xì)胞被有效移除；同時(shí)，EDSS、9HPT、T25FW 與 NfL 的縱向改善與上述分子重塑相一致，支持“清除 BCMA? 漿細(xì)胞—緩解 CNS 炎癥—改善功能”的因果鏈條。

開啟自身免疫病 CAR-T 治療新方向，烈冰生物持續(xù)賦能創(chuàng)新
該研究不僅證實(shí)抗 BCMA CAR-T 是 PMS 的潛在治愈性療法，更開創(chuàng)了 “CAR-T 治療中樞自身免疫病” 的新領(lǐng)域。而烈冰生物在其中展現(xiàn)的 “單細(xì)胞多組學(xué)整合分析能力”，從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化、數(shù)據(jù)質(zhì)控到機(jī)制解析，全程為研究保駕護(hù)航：
1、可處理 “腦脊液低細(xì)胞量、高雜質(zhì)” 等特殊樣本，確保數(shù)據(jù)可靠性；
2、 能實(shí)現(xiàn) “轉(zhuǎn)錄 - 蛋白 - 表觀” 多維度數(shù)據(jù)聯(lián)動(dòng)，深度挖掘細(xì)胞功能與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；
3、 擅長將單細(xì)胞機(jī)制與臨床療效關(guān)聯(lián)，為轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究提供 “從數(shù)據(jù)到結(jié)論” 的完整解決方案。
未來，烈冰生物將繼續(xù)聚焦單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù)在腫瘤免疫、自身免疫病、神經(jīng)疾病等領(lǐng)域的應(yīng)用，為更多突破性研究提供精準(zhǔn)、高效的實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析支持，助力加速臨床轉(zhuǎn)化。
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2025.09.020